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　　中國人以白為美的傳統(tǒng)審美觀念，使美白化妝品成為國內(nèi)護(hù)膚品市場中最活躍的領(lǐng)域之一。而基于中國人皮膚黑色素的合成代謝特性開發(fā)適合中國人皮膚的美自化妝品，也必將是未來美白化妝品的研發(fā)方向。近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的快速發(fā)展，分子藥理學(xué)技術(shù)在化妝品安全性和功效性評價等領(lǐng)域中得到了推廣和應(yīng)用。而歐盟禁止化妝品動物實(shí)驗(yàn)，提倡用動物替代實(shí)驗(yàn)進(jìn)行化妝品評價，也使體外細(xì)胞水平評價成為檢驗(yàn)化妝品功效的重要手段。美白類化妝品體外細(xì)胞水平評價體系的建立，將為該類化妝品的研發(fā)及應(yīng)用提供指導(dǎo)。

　　作為第三方檢測中心，中科測試機(jī)構(gòu)擁有CMA和CNAS認(rèn)證檢測資質(zhì)，檢測設(shè)備齊全，數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，可出具國家認(rèn)可的化妝品美白功效評價報告。

　　美白功效評價細(xì)胞模型的建立

　　1、黑色素瘤細(xì)胞模型

　　早期采用小鼠B16 黑色素瘤細(xì)胞模型進(jìn)行美白劑篩選和評價。B16細(xì)胞為篩選美白劑的首選細(xì)胞，其次為人表皮黑素瘤細(xì)胞A375 細(xì)胞，但 B16、A375 為腫瘤來源細(xì)胞，與人體正常黑色素細(xì)胞存在生理生化反應(yīng)上的差異，僅用于美白劑的大規(guī)模或高通量初步篩選。

　　2、黑色素細(xì)胞模型

　　從活檢獲取的正常皮膚材料中原代培養(yǎng)的人表皮黑色素細(xì)胞（Human Epidermal Melanocytes，HEM），其分裂增殖能力強(qiáng)、標(biāo)準(zhǔn)化程度高、批間差異小，具有與體內(nèi)相同的產(chǎn)生黑色素顆粒的功能。HEM在醫(yī)學(xué)上被用作色素類疾病的藥物體外篩選模型，目前也被用于美白劑的大規(guī)模篩選和細(xì)胞毒性評價。HEM細(xì)胞模型可以從定性和定量兩方面評價待測物質(zhì)的毒性作用和美白功效。

　　3、含黑色素的重建皮膚模型

　　與單層細(xì)胞相比，HEM與多種皮膚細(xì)胞在生物支架或材料上共培養(yǎng)建立的三維或重構(gòu)皮膚模型模擬了正常皮膚的結(jié)構(gòu)，可用于評估黑色素形成過程中多種細(xì)胞相互作用，也便于控制培養(yǎng)條件，探索美白劑的作用機(jī)制。

　　美白功效在體外模型上的評價

　　1、黑色素合成測定

　　1）黑色素細(xì)胞活力

　　美白劑作用后的黑色素細(xì)胞，其數(shù)量和活力的變化反映了美白劑的效果。用光學(xué)顯微鏡觀察美白劑作用后的黑色素或黑色素瘤模型細(xì)胞狀態(tài)MTT（四唑鹽比色法）觀察美白劑對模型細(xì)胞的體外增殖能力的影響，可初步評價美白劑的細(xì)胞毒性作用及對黑素細(xì)胞的生長抑制作用。

　　2）黑素含量測定

　　將黑素瘤細(xì)胞用葡糖胺培養(yǎng)至完全白化，再加入茶堿促細(xì)胞回復(fù)到黑色素合成狀態(tài)，同時加入試樣，鏡檢細(xì)胞顆粒的色調(diào)判斷樣品對新生的黑色素抑制/促進(jìn)效果。最后對細(xì)胞顆粒進(jìn)行離心分離使細(xì)胞內(nèi)顆粒釋放出來，分光光度法進(jìn)行黑色素總量的測定。

　　3）黑素合成相關(guān)因子測定

　　酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是黑色素合成途徑中的主要限速酶，主要通過影響酪氨酸轉(zhuǎn)化成多巴，以及多巴氧化為多巴醌來影響黑色素的生成其酶活性的大小決定黑色素的數(shù)量。一些美白劑如曲酸及熊果苷等，通過抑制 TYR 的活性來抑制黑色素的生成。因此，可以通過測定美白劑對TYR的抑制結(jié)果來評價其功效。TYR活性檢測方法有放射性同位素法、免疫學(xué)法和生化酶學(xué)法，最常用的為生化酶學(xué)法。

　　2、黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)能力測定

　　抑制黑色素從表皮黑色素細(xì)胞向角質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和分布可用于評價化妝品的美白功效。黑色素生成后的轉(zhuǎn)移分為兩步，胞內(nèi)轉(zhuǎn)移和胞外轉(zhuǎn)移。胞內(nèi)轉(zhuǎn)移是黑色素細(xì)胞受內(nèi)分泌或紫外等刺激產(chǎn)生的黑色素體，包裹在黑色素細(xì)胞中向突起末端遷移。這個過程需要分布于細(xì)胞樹突微管上的微管發(fā)動蛋白推進(jìn)。其中小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia Associated Transcription FactorMITF）是黑素細(xì)胞生長、分化及色素生成的主要調(diào)節(jié)蛋白，MITF通過控制角質(zhì)細(xì)胞中捕獲黑色素體的蛋白的表達(dá)在黑色素體轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。根據(jù)黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)通路，可從抑制黑色素細(xì)胞突起形成、阻礙角質(zhì)細(xì)胞對黑色素的攝取、抑制角質(zhì)細(xì)胞吞噬活性或作用于MITF抑制黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)等關(guān)鍵步驟設(shè)計實(shí)驗(yàn)研究美白劑的作用。對MITF的定量檢測可以反應(yīng)出黑色素的胞內(nèi)轉(zhuǎn)移能力，其檢測可采用Western Blot半定量法和商品化ELISA定量試劑盒。

　　3、角質(zhì)細(xì)胞黑色素攝取測定

　　黑素前體蛋白Pmel 17/gp100是一種黑素細(xì)胞特異性蛋白，在黑素細(xì)胞的分化與成熟中起到重要作用，Pmel 17是跨膜蛋白，其細(xì)胞外部分可以從黑素小體上脫落而被釋放到培養(yǎng)基中，采用ELISA 法可以測定培養(yǎng)液中脫落的可溶性Pmel 17濃度，從而作為黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)能力的檢測指標(biāo)。

　　4、三維皮膚模型整體模擬評價

　　將待測物直接涂布于含有黑色素細(xì)胞的人工皮膚模型表面，作用一段時間后，檢測深層的黑色素細(xì)胞的變化，檢測指標(biāo)包括黑色素顆粒的定量、酪氨酸酶活性測定、黑色素特異性抗原 Melan-A/MART-1免疫熒光分析等。還可利用像素分析軟件定量檢測角質(zhì)細(xì)胞攝取黑色素的量，以及檢測培養(yǎng)基中的角質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞炎癥因子的變化等。三維皮膚模型上的評價技術(shù)結(jié)合了體外單層細(xì)胞模型上生化及分子生物學(xué)檢測技術(shù)，以及動物、人體實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)評價方法，可對美白劑進(jìn)行安全和功效的全面綜合評價。